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蛋白质定量检测的方法(蛋白质定性测定方法有哪些)

来源:www.haichao.net  时间:2023-01-20 22:10   点击:131  编辑:admin   手机版

1. 蛋白质定性测定方法有哪些

Liebermann-Burchard反应,是三萜类的颜色反应:将三萜类溶于乙酸酐中,加浓硫酸-乙酸酐(1:20)数滴,可产生黄→红→紫→蓝等颜色变化,最后褪色

通过化学变化改变了化学物质的颜色。硝酸与蛋白质反应,可以使蛋白质变黄。这称为蛋白质的颜色反应,常用来鉴别部分蛋白质,是蛋白质的特征反应之一。

蛋白质:

双缩脲反应

两分子尿素(NH2-CO-NH2)加热至180℃左右生成双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色配合物,此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键,其结构与双缩脲相似,也能发生此反应。

可用于蛋白质的定性或定量测定。任何蛋白质或者蛋白质水解中间产物都有双缩脲反应。这个性质显示和蛋白质分子中所含肽键数目有一定的关系。肽键数目越多,颜色越深,但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。

黄色反应

含有苯环结构的氨基酸,如酪氨酸和色氨酸遇硝酸后,可被硝化成黄色物质,该化合物在碱性溶液(如NaOH)中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸,所以有黄色反应,但苯丙氨酸不易硝化,需加入少量浓硫酸才有黄色反应。右图展示了苯酚与硝酸的反应 。

茚三酮反应

除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外,所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。该反应十分灵敏,1:1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应,是一种常用的氨基酸定量测定方法。

茚三酮反应分为两步:

第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛,水合茚三酮被还原成还原型茚三酮。

第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分于和氨缩合生成有色物质

2. 蛋白质的定性测定

蛋白质印迹(Western blotting),是通过抗原抗体的特异性结合来对复杂样品中的某种蛋白进行检测的方法。此方法是一种新的免疫生化技术,其是基于凝胶电泳和固相免疫测定技术发展出来的。

如今免疫印迹已经成为蛋白分析的一种常规技术,因为其既具备固相免疫测定的高特异性和敏感性,又具备SDS-PAGE 的高分辨力。

某种蛋白的鉴定一般使用免疫印迹,并且可以定性和半定量分析蛋白。和化学发光相结合进行检测,能够同时对多个样品同种蛋白的表达量差异进行比较。

3. 蛋白质定性测定方法有哪些项目

主要特点是外观透明清亮,颜色为浅黄或无色,无味无粘性,不能自凝。此外,从化验结果上来看,漏出液的PH值为碱性,比重低于1.015,蛋白质含量低于25g/L.Rivalta试验他的中文名字叫做李凡他试验,不要烦他,他在考试中经常考。其实,他就是黏蛋白定性试验,是检测黏蛋白的。

4. 蛋白质的测定有几种方法

Bradford法测定蛋白质浓度

(一)实验原理

双缩脲法(Biuret法)和Folin—酚试剂法(Lowry法)的明显缺点和许多限制,促使科学家们去寻找更好的蛋

白质溶液测定的方法。

1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法(Bradford法),是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白

质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定

法。

考马斯亮兰G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰的位置(max),由465nm变为595n

m,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。

在595nm下测定的吸光度值A595,与蛋白质浓度成正比。

Bradford法的突出优点是:

(1)灵敏度高,据估计比Lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1g。这是因为蛋白质与染料结合后产生

的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的

多。

(2)测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的

过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好。

因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。

(3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不

干扰此测定法。

5. 蛋白质的定性检测方法

茚三酮反应

茚三酮反应是指在加热条件及弱酸环境下,氨基酸或肽与茚三酮反应生成紫蓝色化合物及相应的醛和二氧化碳的反应,与脯氨酸或羟脯氨酸反应生成(亮)黄色化合物。 该反应可以对氨基酸进行定性或定量分析,可用于法医学上犯罪嫌疑人的指纹采集。

中文名

茚三酮反应

外文名

ninhydrin reaction

分光光度计

570nm 波长

性质

与 脯氨酸、羟脯氨酸反应

概念

肽与 茚三酮反应生成紫蓝色

基本内容

茚三酮反应

ninhydrin reaction

茚三酮反应,即:所有氨基酸及具有游离α-氨基和 α-羧基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质,只有脯氨酸和 羟脯氨酸与茚三酮反应产生(亮)黄色物质。

此反应十分灵敏,根据反应所生成的蓝紫色的深浅,用分光光度计在570nm波长下进行比色就可测定样品中氨基酸的含量(在一定浓度范围内,显色溶液的吸光率与氨基酸的含量成正比),也可以在分离氨基酸时作为显色剂对氨基酸进行定性或 定量分析。在法医学上,使用茚三酮反应可采集嫌疑犯在 犯罪现场留下来的 指纹。因为手汗中含有多种氨基酸,遇茚三酮后起 显色反应。

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